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在全球医药监管日益严格的背景下，欧洲药典（EP）对抗生素的热原检测要求不断更新。许多品种的方法已从传统的家兔热原检测法（RPT，Rabbit Pyrogen Test）转变为细菌内毒素检测法（BET，Bacterial Endotoxin Test）。然而，仅使用BET法可能不足以完全控制热原风险，非内毒素热原（NEP）的“隐形威胁”是当前合规申报的核心挑战，这也是单核细胞活化试验（MAT）法被推上风口的关键原因之一。
法规倒计时：RPT 正式退场，MAT 登上舞台
• 2025.07.01起，EP 11.8补编版正式删除家兔热原法（RPT），MAT 成为唯一被推荐的替代方法[1]；
• 2025年8月，EP 12.0版本发布，进一步强化指导原则：
○ EP 5.1.13（致热原性） 明确规定：若选择BET作为唯一检测方法，必须提供排除产品中存在NEP的详细风险评估报告。
○ EP 2.6.30 正式将单核细胞活化试验（MAT） 列为能够检测所有类型热原（包括内毒素与各类NEP）的法定方法。
• 2026年起，欧洲药品质量管理局（EDQM）在现场核查中，已将“是否建立并执行了有效的NEP控制策略”列为高频检查项目。
这意味着，对于抗生素出海企业而言，NEP已从一个技术概念，升级为一项紧迫的合规必答题。
抗生素中热原控制发展历史概述
EP第三版（1997年版）抗生素热原检测主要以RPT为主，自1986年《欧洲动物保护公约》通过以来，欧洲药典委员会加速开展体外替代方法的应用，以便响应3R原则（减少、优化、替代动物试验）的推进。
抗生素热原检测RPT转变为BET列表[2]
发酵产品 | 从发酵产品衍生的半合成产品 | |
Amphotericin B | Amoxicillin Na | Netilmicin sulphate |
随着时间推移，EP7.0版49种发酵或半合成半发酵抗生素专论中热原检测RPT被BET取代。然而，这场替代浪潮并未覆盖所有抗生素，EP11.0版仍有部分抗生素保留了RPT[3]，其主要原因在于，已有数据不足证明RPT可以被BET替代。
抗生素热原检测RPT未转变为BET列表
类别 | 具体抗生素品种 |
半合成产物 | Amikacin、Chloramphenicol sodium succinate、Colistimethate sodium、Dicloxacillin sodium、Flucloxacillin sodium |
发酵产物 | Kanamycin acid sulfate、Kanamycin monosulfate）、Polymyxin B sulfate |
EP已正式废除RPT，并明确将MAT作为首选替代方法。那么未完成RPT替换的品种该如何锚定适配的热原检测方法？已完成BET替代的49种抗生素，是否就真正实现了热原防控的 “高枕无忧”？
EP5.1.13致热原性 一般性章节中给出答案：
• 只有在排除非内毒素热原性物质存在的情况下，BET法才适用；
• 如果选择BET作为检测特定产品致热原性的唯一方法，则必须对潜在的NEP进行风险评估；
• 若无法排除NEP的存在，则应使用MAT；
• 对于已获批工艺，建议评估其潜在的NEP风险。一旦生产工艺发生变更，也须开展NEP风险评估，并将报告随变更申请一并提交。
抗生素申报合规风险——NEP恰好是“高发区”
抗生素生产的复杂工艺本身，就是NEP的潜在引入点。从上游发酵的原材料与代谢产物，到下游纯化与设备清洁的每个关键步骤，均需进行前瞻性的风险评估。只有对全过程进行系统审视，才能构建起针对NEP的全面防控体系。
抗生素发酵和回收工艺[4]
风险评估内容—存在非内毒素热原（NEP）的可能性有多大？
• 生产工艺用菌株的特性：使用菌为G+或G-，评估是否可能含有脂磷壁酸（LTA）或肽聚糖等热原成分；评估特定蛋白表达水平（例外毒素、其他蛋白质）
• 发酵工艺残留革兰阳性菌（HKSA、LTA）、肽聚糖、酵母多糖等，都属于NEP。这些杂质与LPS协同刺激，可放大细胞因子含量，临床引发放大热原反应
• 评估培养基成分及来源：动物源性（是否存在病毒）、植物源性（是否存在霉菌毒素或是否为合成途径）
• 原材料的生物负载
• 生产工艺中潜在的交叉污染以及环境监测
• 下游工艺去除热原的能力
○ 用有机溶剂进行提取过程，该溶剂能溶解目标化合物但不会溶解水溶性热原物质
○ 过滤工艺用于分离如蛋白质或DNA/RNA等分子量较高的物质
○ 通过使用强酸或强碱来改变pH值，这可能会破坏某些热原物质（即目标化合物是稳定的）
风险评估方法[1]：
EP致热原性5.1.13指出对于那些无法排除存在NEP的药品，建议在进行BET的验证实验时，同时使用相同的3 批次进行MAT交叉验证实验。如果重要工艺参数发生变化，应再次在3批次上进行交叉验证。
EP11.8补编 2.6.30-6.5章节中关于NEP方法验证要求：
• 预实验应包括使用至少2种NEP配体（如肽聚糖、脂磷壁酸、合成细菌脂蛋白、鞭毛蛋白等）对检测系统进行验证，其中至少1种需加标至待检制剂中。
• 如有历史批次中已证实受NEP污染物污染的阳性样品，可优先使用；如无则可选择生产工艺可能引入的NEP对检测系统进行验证。
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PyroSup™ 热原检测试剂盒（MAT法）—试剂盒样品适用性
| 药物或原料 | 名称 | 检测试剂盒 | 前处理试剂盒 | ||||
| 抗生素 | 头孢唑肟钠 | 磷酸特地唑胺 | 法莫替丁 | 盐酸帕洛诺司琼 | 阿洛西林钠 | MAT试剂盒 | / |
| 头孢呋辛钠 | 硫酸阿米卡星 | ||||||
| 小分子药物 | 多黏菌素B&E | MAT试剂盒 | 前处理试剂A | ||||
| 盐酸表柔比星 | MAT试剂盒 | 前处理试剂B | |||||
| 单抗类 | 利妥昔 | 信迪利 | 阿达木 | 尼妥珠 | 雷珠 | MAT试剂盒 | / |
益赛普 | 瑞卡西 | 贝伐珠 | 依洛尤 | 阿利西尤 | |||
疫苗类 | 人用狂犬病疫苗 | 冻干甲型肝炎灭活 | 麻腮风联合减毒活 | 四价流感病毒裂解疫苗 | A群C群脑膜炎 | ||
流感病毒裂解疫苗 | 水痘减毒活疫苗 | ||||||
重组蛋白类 | 重组胰岛素注射液 | 特立帕肽注射液 | 重组人促红素注射液 | 重组人干扰素α-2b注射液 | 注射用重组IL-11 | ||
甘精胰岛素 | |||||||
血液制品类 | 人凝血酶原复合物 | 静脉注人免疫球蛋白 | 人凝血因子Ⅷ | 人血白蛋白 | |||
生化药品类 | 尿激酶 | 琥珀酰明胶 | 胶原酶 | 丁二磺酸苷蛋氨酸 | 谷胱甘肽 | ||
| 甲磺酸齐拉西酮 | 吲哚菁绿 | 甘露聚糖肽 | 烟酰胺 | 还原型谷胱甘肽 | |||
盐酸肾上腺素 | |||||||
注射液 | 参麦注射液 | 香丹注射液 | 生理盐水 | ||||
原辅料 | BSA | 胎牛血清 | 头孢噻肟钠 | 曲克芦丁 | |||
PyroSup™ 热原检测试剂盒（MAT法）
• 合规性与申报基石：细胞来源清晰，已获得商业授权，规避申报合规风险；
• 监管认可与性能稳定：联合权威机构进行全面性能验证，并经过客户及监管机构测试，其质量与性能优于其他同类型产品；
• 强大的技术解决能力：该细胞具备优异的技术适用性，搭配针对性前处理方案，可轻松突破检测场景限制；
• 经过实证的成功案例：已成功支持多个产品完成欧盟/FDA上市申报，拥有成熟的申报经验；
• 资质认证：通过ISO13485质量管理体系认证和CNAS实验室认可，中、美、欧三地申报拥有丰富经验。
参考文献：
[1] Europaea, P. (2025) 2.6.30. Monocyte-activation test-11.8.
[2] Source: EDQM; Animal Welfare Progress; PA/PH/SG (07) 8
[3] Europaea, P. (2020) 2.6.30. Monocyte-activation test
[4] Dr. Uwe Lipke | Phasing out the rabbit pyrogen test – the view from the perspective of antibiotics | 15.02.2023
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