在基于核酸扩增技术（NAT）的支原体检测中，检测限（LOD）常被视作方法灵敏度的核心指标。然而，在实际的方法学验证与应用中，一个常被忽视的问题是：LOD的可靠性首先取决于支原体菌株的质量。

支原体检测qPCR扩增

01 NAT检测的本质：检测支原体核酸

与培养法不同，NAT方法直接检测支原体DNA信号，这意味着：

• NAT无法区分活菌与死菌

• 检测结果高度依赖样品中的基因拷贝数（GC）

dPCR检测支原体GC

对于支原体菌株，行业通用的生物学定量单位是菌落形成单位（CFU），关键在于，GC与CFU之间并不存在恒定比例关系。

02 GC/CFU比值：影响LOD的关键但隐蔽因素

在支原体菌株制备过程中，常面临以下挑战：

• 支原体易聚集，难以均匀分散。

• 不同种类支原体培养条件差异大，工艺复杂。

• 支原体个体微小，不易直接观察计数。

• 培养过程中容易产生死菌。

• 死菌会释放游离DNA，显著抬高GC含量。

当GC/CFU比值过高时：

• LOD在数据上看似更低。

• 实际检测信号可能主要来源于死菌核酸。

• 对于核酸检测而言，高浓度的检测对于检测体系要求反而更低。

• 导致核酸法灵敏度被“虚假放大”。

03 行业共识：并非所有菌株都适合用于LOD验证

• 当前行业普遍认同：

○ ATCC提供的标准支原体菌株在一致性和可追溯性方面更具优势。

○ 多数合格菌株的GC/CFU比通常控制在10以下（除非另有说明）。

○ 应选择适用于NAT方法LOD验证和方法学确认的菌株。

• EP 2.6.7草案（Pharmeuropa 36.1）对于菌株的要求：

○ 支原体应在生长的指数阶段收获，以保证菌株活性。

○ 应在冻存工作悬浮液/稀释液之前测定CFU。

○ CFU的测定应进行一定数量的重复。

○ 对于基因组拷贝数(GC)的测定，必须同时考虑上清和细胞这两种组分。

○ 确定GC/CFU比值的接受标准：除非另有说明，否则参考品的GC/CFU比值应小于10。

• USP 77征求意见稿菌株要求：

支原体培养物应进行计数，并对基因组拷贝（即其GC/CFU比值）进行表征。

• JP G3-14-170菌株要求：

应预先建立菌株库CFU和核酸拷贝数之间的关系（即GC/CFU比值）。

04 为什么菌株质量对QC与法规合规至关重要？

在核酸法支原体检测中，我们不仅应当关注方法是否“足够灵敏”，更要关注：

• 灵敏度是否真实反映污染风险？

• LOD是否建立在生物学真实的验证基础之上？

菌株质量是连接方法性能与放行风险的关键桥梁。此外，标定菌株所用的测试方法是否经过验证，也严重影响了菌株的质量。

• 培养体系是否经过验证，以确保培养基的检测灵敏度。

• GC测定方法是否经过验证，以保证结果的可靠性（不同的GC测定方法可能导致结果差异）。

05 核心结论：

支原体核酸检测，只有基于高质量菌株基础上的低LOD，才具有真正的质量意义。