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无菌检查，即用于确定要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料 、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。各国法规药典中对无菌检查的传统的培养法和薄膜过滤法进行了详细的介绍。随着新型生物制品的涌出，细胞制品的普及，对无菌检查提出了新要求。传统培养方法主要表现为在时效性上无法满足这些生物制品的放行检需求，也包括原物料的质检需求，因为传统培养方法至少需要14天的培养时间才可以出结果。因此，各国陆续建议研发和推广采用经过验证的快检方法--快速微生物检测（RMM，Rapid Microbiological Methods）替代传统无菌培养法检查。基于生物技术的发展，各国药典及法规均鼓励使用基于新技术的经过全面验证的替代方法。
表1 关于无菌检测替代方法的法规指南要求
法规指南 | 内容要求 |
2020年版《中国药典》第四部通则9201. | 药品微生物检验替代方法验证指导原则，包括定性检验&定量检验方法需验证的各项性能 |
《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》.NIFDC.（2018年） | 在可行的情况下，首选药典方法用于无菌检测，但考虑到Car-T细胞产品的特殊性，也鼓励研究者开发快速的无菌检查法作为中间过程监测或放行检测方法，且在临床试验过程中须按照中国药典要求以及其它国际要求对快速无菌法进行充分验证。且在早期使用时，快速方法应与药典方法平行进行，在获得充分的比对数据后，结合无菌生产全过程的风险评估设计放行策略，才有可能替代药典方法。 |
人源性干细胞产品药学研究与评价技术指导原则.CDE.（2021年） | 无菌检测-细菌、真菌：鼓励采用现行版药典培养法进行无菌检测，可依据工艺阶段、管理需要、临床应用需要等，采用不同时间针对不同工艺阶段的细胞，选择不同检测方法，如采用全自动细菌/分枝杆菌检测系统或革兰氏染色法镜检，或基于核酸或特定代谢物的快速检测方法。选用快速检测方法应进行适用性评估，并逐步完成全面的方法学验证和与药典法的比对，以证明检测能力相当。 |
USP<1223>Validation of Alternative Microbiological Methods. | 介绍了多种替代方法，并详细阐述了各方法作为替代法需验证的性能。 |
USP<1071>Rapid microbial tests for release of sterile short-life products：a risk-based approach. | 介绍了有效期较短的无菌产品放行的快速微生物测试-基于风险的方法，包括ATP生物发光法、核酸扩增法、流式细胞术等，并详细阐述替代方法特点。 |
EP2.6.27 Microbiological examination of cell-based preparations. | 介绍了基于微生物生长原理的各替代方法。 |
EP2.6.21 Nucleic acid amplification techniques. | 介绍了核酸扩增法可作为替代方法，并详细阐述了该方法作为替代法需验证的性能。 |
表2 无菌检测替代方法介绍
替代方法 | LOD（CFU） | 时间 | 原理 | 检测对象 | 样品量（mL） | 优点 | 缺点 |
ATP生物发光法 | 1-10/10³ | 2-7天（富集养）/30分钟 | 检测 ATP在反应过程中产生的荧光强度，间接测定微生物含量 | 1-1000 | 操作快速简便重现性好 | 未富集培养灵敏度较低富集培养则增加时长 | |
流式细胞法 | 10-100 | 6-8小时（富集培养） | 荧光染料标记微生物细胞，激光照射检测微生物含量 | 活菌 | 0.1-2 | 自动化标准化 | 需经微生物富集培养后方可检测需要特殊仪器 |
恒温微量热量计 | 10⁴ | 2-7天 | 监测微生物生长焓变化采用设备自动计数 | 活菌 | 1 | 自动化标准化 | 灵敏度较低需要特殊仪器具体应用尚未确定 |
呼吸作用 | 1-10 | 2-7天 | 监测微生物产生CO₂含量采用设备自动计数 | 活菌 | ≤10 | 转接操作简便免去主观结果判断 | 样品存在局限性需要特殊仪器 |
固相细胞计数 | 1-10 | 2-3小时 | 将过滤后的微生物在滤膜上进行荧光标记采用设备自动计数 | 活菌 | 1-1000 | 灵敏度高时间短 | 样品存在局限性不可过滤样品不适用需要特殊仪器 |
核酸扩增 | 1-100 | 2-4小时 | 实时定量PCR（qPCR）扩增保守序列，检测多种微生物 | 活菌&死菌 | 0.2-2 | 准确度高灵敏度高时间短、实时监测同时检测多种微生物可检测多种不可培养微生物 | 需要特殊仪器成本较高 |
无菌检测替代方法的验证要求
为了正确实施替代方法，在选择分析技术并确定使用该方法对实际样品进行测试之前，须考虑方法的优缺点以及任何关键内容，包括但不限于选择合适的替代方法，根据设备确定的测试标准，证明该方法替代标准药典方法的适用性，以及在实验室如何对方法进行验证。
法规中关于替代方法学的验证要求见下表：
验证要求（定性试验） | 中国药典 | EP2.6.21 | USP<1223> | 内容 |
适用范围 | + | - | - | 包含方法的完整信息，包括核酸靶标序列、适用样品基质、已被测试核酸量（gDNA / pDNA）等，需要报告这些测试的结果。此外，应对其他分析物的干扰及其对某些基质和条件的不适用性进行说明。 |
专属性 | + | + | + | qPCR检测体系检验其他非被检测物的能力，通过专属性检测以确保体系只与靶标序列反应。 |
检测限 | + | + | + | 即样品中可检测到的被检物的最低量的概率，该性能表示的可能不是一个精确值。在95%置信度下，被检物至少95%阳性重复检出的最低浓度 |
耐用性 | + | + | + | 指不受方法参数微小但有意变化影响，并在正常使用时提供可靠数据结果的能力。 |
重现性 | + | - | + | 相同的样品在正常的试验条件（如实验地点、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。 |
样品适用性 | + | + | + | 样品按替代方法适用性规定的参数逐一进行验证，以确认替代方法可否用于该样品的检验。 |
等价性 | - | + | + | 对验证参数进行2种定性方法的等效性测试。 |
假阳性 | + | - | + | 应设置合适的系统参数尽量避免出现假阳性或假阴性结果，应对不同类型和不同浓度基质对方法假阳性和假阴性结果影响进行评估，对假阳性或假阴性检出率要求为不得检出 |
MicroSHENTEK®方法介绍
真菌细菌皆有细胞壁，特别是真菌细胞壁多为葡聚糖、几丁质等坚硬组分。为此，湖州申科建立了高效稳定、标准化的锆珠-磁珠提取方法，实现在不同样品基质下的细菌真菌DNA的有效、稳定的提取，确保高灵敏度实现MicroSHNETEK®细菌真菌qPCR检测。
荧光探针qPCR方法灵敏度高、特异性强、检测时间短等已被广泛应用于基因工程药物的相关检验中，如宿主细胞DNA残留检测，靶基因拷贝数检测，支原体快检等等。对所使用的前处理方法和相关的qPCR检测都进行了充分验证，替代了原有的一些传统技术方法，获得了监管部门的认可，成功用于生物制品的QC、研发、注册申请等等。
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湖州申科基于锆珠-磁珠法的真菌/细菌DNA提取试剂盒，基于荧光探针qPCR法的真菌/细菌DNA检测试剂盒。
• 适用范围广：
适用于定性检测细胞培养物（主细胞库&工作细胞库等）、细胞培养衍生的生物制品（疫苗&细胞治疗产品等）中的真菌/细菌污染。
可有效提取检测多种高浓度细胞基质（10⁶Vero、293T、CHO等）、5%人血白蛋白、高浓度质粒样品中真菌/细菌DNA。
• 专属性好：
验证了多种非真菌或非细菌物种的微生物和常见工程细胞，专属性好。
• 灵敏度高：
检测限低于100 CFU。
• 设计可靠：
包含内部质控（IC）和阴阳性质控（PC、 NCS、 NTC），有效完整监控提取检测过程。
• 简单快速：
样品经前处理后提取检测，全程仅需6小时。
• 污染风险低：
体系包含dUTP/UNG酶防污染系统，可有效预防气溶胶污染情况发生，降低污染风险。
检测试剂采用预混型溶液，最大限度降低由移液导致的污染风险。
• 通量高：
可实现自动化提取检测1-32个样品/次。
• 符合法规：
提取检测方法均经过全面验证，符合药典法规要求，可提供验证报告。
• 质量保证：
ISO13485体系认证，GMP-Like生产，可提供质检报告。
• 资质符合要求：
湖州申科拥有完善的仪器设施，包含有备案资质的P2实验室，细胞房，PCR实验室，厌氧培养系统等。
湖州申科将提供一整套实验污染防控规范指导解决方案，帮助用户建立微生物快检检测体系以满足无菌检查要求。
湖州申科提供药典规定的验证用真菌/细菌菌株。菌株来源正规，可溯源，用培养法和dPCR法检查表征。
货号 | 产品名称 |
1504631 | |
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