生物制品通常由连续传代的工程菌或工程细胞表达（如CHO、E.coli、毕赤酵母、Vero等），其宿主细胞DNA（HCD）虽经过一系列的纯化工艺，终产品中仍可能残留宿主细胞的DNA片段，是生产过程中不可避免的工艺相关杂质，引发免疫副反应等风险。尤其值得关注的是，残留DNA的致瘤性风险并非仅由片段大小决定，核心取决于是否包含完整的功能性致癌序列及实际暴露剂量，大片段残留DNA（超过200 bp）因更易携带完整基因序列，其潜在致瘤和感染性风险相对更高。

国内外监管部门将生物制品宿主细胞残留DNA片段作为一项影响产品质量安全的重要指标，加以控制并对此类风险做了明确的法规要求。

01 起源：一场关于“看不见的杂质”的集体忧虑

HCD风险研究最早始于上世纪50年代，美军流行病学委员会提议禁用致瘤及人源肿瘤细胞制备人用疫苗，担忧残留DNA存在致癌隐患，该建议沿用四十余年，业内对于残留DNA风险性长期存有学术争议。

上世纪80～90年代，重组DNA技术落地，重组胰岛素、干扰素等首批生物药问世，行业研究重心从判定有无风险转变为探究风险阈值，依托癌基因模型开展残留DNA致癌风险定量研究，相关质控规范逐步落地。1976年美国NIH发布《重组DNA分子研究指南》，为后续HCD相关安全标准制定奠定基础。

80年代FDA、WHO出台早期管控标准，限定非口服生物制品HCD≤100 pg/剂，依靠严苛限值实现保守风控。伴随科研进步，研究证实完整致癌基因致瘤剂量达微克级别，远超药品实际残留量，监管据此优化限值：通用标准调整为10 ng/剂，单抗产品多沿用100 pg/剂，乙肝疫苗收紧至10 pg/剂。监管模式由保守限量转向科学量化风控，同步带动HCD检测技术迭代升级。

02 发展：HCD检测技术跃迁

HCD检测技术的发展并非一蹴而就，而是经历了从 “无从下手”到“定性检测” ，再到“精确定量” ，最终迈向 “科学评估” 的完整进化。

2.1 早期检测手段：杂交法、荧光染料法

• 体内安全性试验：早期质控核心方式，可整体验证产品活体安全性，但无法定量HCD，不能指导生产工艺优化。

• DNA探针杂交法（90年代初）：首个特异性HCD检测方案，用地高辛标记探针结合目标DNA显色；其局限也显而易见，流程繁琐耗时长达数日、只能实现半定量或相对定量、可靠检测下限在10 pg左右。尽管如此，它仍是质控史上从0到1的关键突破，为行业树立了最初的标尺。

• 阈值法：基于生物素-SSB和尿素酶-抗ssDNA单抗与变性DNA结合，通过尿素酶催化尿素分解导致的pH变化进行定量。但因对小片段干扰敏感，且高浓度样品信号抑制等原因逐渐退出历史舞台。

• PicoGreen荧光染料法：染料结合双链DNA，在特定波长激发下产生荧光，强度与DNA浓度成正比，可实现对HCD的定量检测。该方法具有操作简便、成本低廉等优势，但因其非特异性检测（可检测所有dsDNA）且灵敏度较低，不建议单独用于终产品放行检测。

2.2 里程碑：qPCR成为标准方法

2000年后，实时定量聚合酶链式反应（qPCR）技术开始成熟，利用特异性引物和探针实现痕量DNA的指数级扩增与实时监测，实现了从定性到定量的飞跃。qPCR法凭借其高灵敏度（可达fg级）、强特异性、宽线性范围以及高通量优势，迅速成为行业标准方法。自2015年起，USP、中国药典等均将其推荐为标准方法，其稳定性、可重复性和法规依从性经过了长期验证。

2.3 待观望：绝对定量dPCR（数字 PCR）

dPCR依靠微滴拆分 + 泊松统计实现核酸绝对定量，无需标准曲线，抗样本干扰能力优异，多用于基因拷贝数测定。然而，dPCR在面对实际的HCD残留质控检测时，目前还面临一些待解决的问题：

• 投入成本高：dPCR系统价格显著高于常规qPCR设备，相对而言耗材、试剂效期短，整体投入大。

• 检测结果差异：不同dPCR技术平台差异，样本处理和加样误差极其敏感，缺乏统一的标准物质，导致检测值不一致；特别是在面对残留量低浓度样本时，检测值差异明显。

• 操作复杂性增加‌：需额外进行微滴生成、芯片封装等步骤，对人员操作规范性和实验室环境要求更高。线性检测范围窄（3~4 个数量级，qPCR可达5~6个），高浓度样本需多次稀释。

dPCR通过“阳性/阴性”的二元计数，基于泊松分布的统计学模型，直接推算出样本中目标分子的拷贝数 。这个推导过程实际蕴含着多种不确定性因素：泊松分布的校正误差，“换算效率”的偏差，微滴生成的均一性，对于不同抑制剂的敏感度差异等。在生物制品HCD残留质控检测上，dPCR如何在不同技术平台上实现检测值的统一，以及提高标准化操作还需要更多努力。

03 从总量控制到片段分析：理念升级，方法互补

近年来，监管机构（如FDA、WHO、CDE）对HCD的管控不仅要求残留总量达标，更强调DNA片段大小（Size）与潜在风险的关联。特别是在Vero、MDCK这类非肿瘤来源但具一定转化潜能的连续细胞系中，大片段DNA（>200 bp）因更易携带完整的癌基因或病毒基因序列，成为潜在致瘤与感染风险的重要来源。因此，最新的检测技术已不再满足于报告一个总数值，而是结合片段分布进行综合风险评估。

• 2006年，WHO专家组会议达成共识，认为将残留DNA片段大小控制在200 bp以下，可通过减少完整基因序列的存在概率，进一步降低致瘤性和感染性风险。这是国际上首次将片段大小作为一个明确的风险控制指标。

• 2010年，FDA在其发布的生物制品相关指南中明确指出，可通过降低残留DNA含量和减小DNA片段大小来降低风险，并要求在产品中检测DNA的含量和片段大小分布。

• 2022年，CDE发布《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》，明确要求对DNA残留量和残留片段大小进行控制，并建议将残留片段大小控制在200 bp以下。这是国内首次在指导原则层面对此作出明文规定。

3.1 毛细管电泳法（CE法）

毛细管电泳法（CE法）是目前用于检测宿主细胞残留DNA片段大小和分布的主要技术之一。该方法主要基于电泳原理，即DNA片段在电场中会因大小不同而以不同速度迁移，整个过程在毛细管中进行，最终生成一个直观的电泳峰图，图上每个峰的位置代表一种特定大小的片段，峰高则反映其相对含量。CE法尤其适用于工艺研发和优化阶段，帮助直观地评估不同工艺条件对DNA片段大小的影响。

3.2 多重qPCR片段分析技术

HCD qPCR检测技术也可通过间接分析实现DNA片段大小分布的推断。

湖州申科研制的HCD片段化分析检测试剂盒基于多靶点qPCR原理，通过在宿主细胞基因组上设计3-5个不同长度扩增子作为"分子标尺"，分别定量检测样品中对应长度片段的DNA残留量（如CHO残留片段分析检测试剂盒设计了95bp、110bp、215bp、523bp四个不同的扩增片段，Vero残留DNA片段分析检测试剂盒则设计了85bp、134bp、229bp、552bp四个片段）。该试剂盒采用"相对丰度比"分析法，以最短片段扩增子（84bp）的定量值为基准（设为1），计算其他各长度靶点的相对比值，从而推断样本中残留DNA的片段分布状态。

• 若各长度靶点比值均接近1，提示样本中不同片段长度DNA分布均匀，存在大量完整长链DNA，片段化程度低；

• 若长片段靶点比值显著低于短片段，说明DNA已被充分降解，残留主要为小片段，风险相对较低；

• 若仅短片段有检出而长片段无信号，表明DNA高度片段化；

• 若所有靶点比值均极低或无信号，则表明总DNA残留水平已得到有效控制。

通过观察比值从短片段到长片段的递减趋势，可直观评估残留DNA的片段化程度与完整性。这一创新方案依然建立在qPCR平台之上，利用其稳定定量能力实现风险深度评估，与CE法互补，共同定义DNA片段大小。

04 未来：标准化与新技术探索

4.1 标准化与自动化

面对趋严的监管要求和多样化的生物药类型，HCD检测技术正朝着更精准、更高效、更高通量的方向发展。qPCR方法已高度标准化，自动化设备普及进一步提升了检测效率。

4.2 NGS：探索“读懂”内容

面对生物制品HCD的复杂性，我们用下一代测序（NGS）试图回答一些更深层的问题：这些残留的DNA究竟是什么序列？它们携带了哪些基因？是否存在已知的致癌元件或病毒整合位点？

NGS技术目前更多应用于研发阶段的深度表征和风险识别，在常规放行检测中面临诸多挑战：成本高昂、数据分析复杂，且对操作和生信分析的要求极高，缺乏统一的行业标准和验证指南。正因如此，NGS正从“研究工具”向“合规平台”加速演进——随着USP、EP等药典机构积极推进NGS标准化，以及ICH Q5A指南对NGS用于病毒检测的认可，NGS有望在未来成为HCD风险评估的重要补充工具。

HCD检测相关论文：

[1] Danhua Zhao,Weiying Zong,Wanxin Wu,Yuhua Li,Zongsong Wu,Zhixing Yang.Shouchun Cao. Development and validation of a qPCR assay for the detection of residual host cell DNA in rabies vaccines produced in Vero cells[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2025, 13.

[2] 邱冉,张青梅,乐洋,纪德铭,吴东萍,张晓宇,李芳,吴文逸,袁小铃,张琪梦,刘博,张哲罡.大流行流感全病毒灭活疫苗(H5N1)中宿主残留DNA片段大小分析方法的建立,验证及应用[J].中国生物制品学杂志,2025,38(12):1451-1468.

[3] 王光裕,杨靖清,魏长龙,周泽鑫,杨志行,黄钰,周勇.首批HEK293细胞DNA含量测定国家标准品的制备[J].中国生物制品学杂志,2024,37(3):316-321.

[4] 豆敏华,朱冰美,宗伟英,吴晓双,杨志行.建立CAR-T细胞治疗产品质量控制检测方法及其定量参考品的数字PCR方法研究[J].中国新药杂志,2021,30(24):2306-2314.

[5] ]武刚,付志浩,杨志行,崔永霏,张荣建,宗伟英,王兰.定量PCR-Taqman探针法检测NS0宿主细胞残留DNA的方法学验证[J].中国药学杂志,2019,54(24):2001-2009.

[6] 吕萍,杨志行,张慧,宗伟英,吴婉欣,王滔,梁成罡.CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒(PCR-Taqman探针法)的方法学验证[J].中国新药杂志,2018,27(21):2519-2526.