基因治疗药物在病毒载体生产工艺中，常用非特异性核酸酶来消解和降低宿主细胞核酸的残留量。作为一种内切核酸酶，非特异性核酸酶能够降解各种形式的核酸，对双链、单链、线状、环状和超螺旋形式的DNA/RNA的磷酸二酯键均具有很高的活性，是最有效的核酸去除方法。

目前市场上主流的非特异性核酸酶产品大多采用大肠杆菌重组表达，如Merck的Benzonase核酸酶。因此，在非特异性核酸酶产品生产过程中，不可避免地引入了宿主细胞E.coli残留DNA。

因宿主细胞残留DNA潜在的致癌性和感染性等风险，各国监管机构对其均有严格的限度要求。相关研究表明，残留DNA片段风险随长度增加而增加，相对而言，小于200 bp的风险较低。因此，在病毒载体生产过程中，要尽可能降低HCD残留量（<10 ng/剂），尤其是大于200bp HCD片段的存在。这就需要建立高灵敏度、高特异性的HCD残留量和HCD片段分析检测方法。一方面，可以通过分析HCD残留量和片段大小来评估并不断优化病毒载体生产工艺（包括非特异性核酸酶的用量、作用时间、作用温度等）。另一方面，可有效保障病毒载体HCD残留量和片段大小控制在限度范围内，降低潜在风险。

病毒载体生产过程中，可以通过评估HCD的残留来对非特异性核酸酶的使用进行优化，主要包括以下步骤：

1）分析检测未处理的过程中间品中HCD残留量和HCD片段大小分布；

2）根据非特异性核酸酶的酶活计算所需酶量；Benzonase可参照以下公式：

X（μ/ml）=DNA浓度（μg/mL）/37

3）设定梯度酶浓度（如0.5×，1×，2×，3×等），作用时间（如1、2、4、8、12、24小时等），作用温度（20，25，37℃）及测试规模；

4）收集不同工艺点核酸酶处理后的样品，检测HCD残留和HCD片段大小分布。

基因治疗用病毒载体实际生产过程中，需要规模化的GMP级质粒用于转染步骤，过程还涉及质粒制备（图2）。因此，除了工艺引入的非特异性核酸酶中存在的宿主DNA残留外，还需严格控制质粒E.coli宿主细胞残留DNA、RNA和残留蛋白。

需要特别注意的是，FDA提醒使用HEK293T细胞生产病毒载体时因存在SV40 T抗原，还需要检测残留的腺病毒E1（E1A & E1B）和SV40 T抗原序列。《中国药典》有关生物制品宿主残留核酸质量控制要求和CDE颁布的《细胞治疗产品申请临床试验药学研究和申报资料的考虑要点》中关于质粒和病毒载体的质量标准也提到，如使用HEK293细胞进行病毒载体生产，需进行宿主DNA和RNA残留、SV40大T抗原DNA残留、E1A和E1B基因DNA残留检测。

重点关注：

• 非特异性核酸酶广泛应用于病毒载体生产中的核酸残留消解；

• 对病毒载体生产过程中相关DNA需要全面检测分析，包括病毒载体包装生产所用的细胞系HCD，特定细胞系所携带的风险基因，以及HCD的片段分布；

• 高品质全面的HCD及风险基因DNA检测试剂盒使得核酸酶处理工艺的优化保证了稳定的残留核酸清除和高质量的病毒载体。

湖州申科基于基因治疗用病毒载体生产相关质控风险，研发了一系列具有自主知识产权的宿主细胞DNA残留量及片段分析检测试剂盒、HEK293细胞系HCD和相关风险基因检测试剂盒，以及非特异性核酸酶残留检测试剂盒等，能够快速检测基因治疗产品研发和生产过程的中间品、半成品和成品中核酸和由此引入的工艺杂质残留。

✦ HEK293细胞系HCD及风险基因检测：

✦ 非特异性核酸酶残留检测：

✦ 宿主细胞残留DNA/RNA检测：

✦ 宿主细胞残留DNA片段分析检测：

试剂盒操作简便，专一性强，已广泛用于基因治疗病毒载体相关研发、生产及技术监管单位的质量检测控制，为生物药的安全保驾护航。