实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（qPCR）是目前最常用的DNA定量方法，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭式反应等优点。作为一项实用性强且经过充分验证的技术，qPCR已成为生物制品质量控制检测常用方法并被纳入各国法规。

qPCR技术具有高度敏感性，实验的各个环节，无论是实验设备的精准性、耗材和试剂的稳定性、人员和环境的影响等因素均会造成从样品制备到结果分析的偏差。因此，在实验室环境、人员的操作等方面需严格控制，以避免交叉污染并保证qPCR检测结果的准确性和重复性。基于此，应对qPCR实验室开展能力验证，如发生检测结果与指定值或其他能力评价标准之间存在明显差异的情况，应及时调查潜在的误差或不满意结果的来源，识别存在的问题并启动纠正与预防措施，改善实验室质量管理，提高实验室检测能力。

对生物制品质量控制检测qPCR实验室来说，可以从实验室设计方案、质量体系和流程、实验人员能力考核、检测方法学建立等四个方面来帮助质量检测部门全面验证qPCR实验室检测能力，以达到控制产品质量和持续改进的目的；同时，针对人员和测试要求设计理论和实验培训计划，逐步完善qPCR技术的实际操作能力和检测方法。

qPCR实验室设计方案

针对测试样品和试剂对人和环境是否存在潜在的危险性，qPCR实验室可分级防护，通常分为P1实验室和P2实验室。

 • P1 实验室

样品和试剂对人体、动植物或环境危害较低,不具有对健康成人,动植物致病的因子。实验室内部独立操作区域包括：

① 阳性混合区（处理含靶标核酸片段的阳性样本的区域）；

② 阴性混合区（处理无模板材料的区域，例如引物、缓冲液等）；

③ 样本混合区（处理试剂、样品和反应体系的区域）；

④ PCR反应区（反应体系上机扩增的区域）；

各区域须做好明显的标识，配备独立的设备、试剂及耗材，不允许交叉使用。实验试剂、待测样品、PCR产物分开存放。减少在实验区内不必要的走动，以降低污染发生的可能性。 

• P2 实验室

适用于对人体、动植物或环境具有中等危害或潜在危险的致病因子，但对健康成人、动物和环境不会造成严重危害，须划分独立区域，包括：

① 试剂储存和准备区（试剂的储存、制备、分装和扩增反应混合液的准备）；

② 样品制备区（样品的核酸提取、储存及加样）；

③ 扩增反应区（DNA扩增及检测）；

④ 扩增产物分析区（必要时，用于扩增产物的分析）；

避免污染、保证环境安全是P2级qPCR实验室设计建设首要考虑重点，因此各区域需完全独立。此外，由于在使用过程中因为离心、混匀等操作会产生气溶胶，各区域不应有空气的直接相通，需设计合理的压力梯度，形成有序的气流组织方向。

质量体系和流程

为保证qPCR实验的质量，应建立和运行合规的实验室质量管理体系，包括质量目标、组织架构、工作流程、岗位职责、过程控制和资源协调等。质量管理体系文件，应当包括质量手册、管理制度、程序文件、岗位职责、记录文件等，确保一切活动有章可循，有据可查；把管理要素和技术要素融入到实验室工作系统中，充分有效地控制影响检测质量的各种因素。

实验室工作的监督管理通常有管理评审、内部审核、质量监督，大致要求如下：

实验人员能力考核

在实验室运行过程中，人、机、料、法、环五大要素缺一不可。人的因素是最根本的、决定实验室检测的正确性和可靠性的第一因素,人员的综合素质决定工作质量。检测人员要求生物技术或相关专业背景，具备qPCR技术的理论知识和实际操作能力，掌握实验室生物安全要求并通过能力考核。

检测方法学建立

以2020版《中国药典》为例，qPCR定量分析方法建立的指导原则和qPCR定性/定量分析分析方法收录如下：

对建立的qPCR方法，还应进行方法学验证。qPCR定量检测实验，需在验证过程中确定方法的适用范围和可行性，考察方法的专属性、定量限、扩增效率、线性、范围、准确度、精密度、耐用性，同时还需要确定方法的不确定度；qPCR定性检测实验，需在验证过程中考察方法的适用范围、可行性、专属性、检出限、耐用性和重现性，同时还需考虑如何排除假阳性和假阴性结果。

根据实验室管理制度和qPCR检测方法验证及测试要求，湖州申科生物技术有限公司可提供针对qPCR实验室相关实验人员的理论和实验培训及考核服务，还可提供从实验室设计到结果分析的全流程指导服务，以对qPCR实验室能力进行验证，帮助生物制药公司在不同阶段（如体系建立、资质申请和项目申报等），建立符合要求的质控实验室，为生物制品质量保驾护航。