腺相关病毒（Adeno-associated Virus, AAV）属细小病毒科无包膜的线状DNA病毒，只有在辅助病毒（通常是腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在下才能实现病毒复制。AAV能感染多种类型的人体细胞，因此又被分为多种血清型，现在发现的腺相关病毒有十多种常见血清型以及上百种变种。

典型的AAV2基因组为4679 bp，由两个反向末端重复序列（Inverted Terminal Repeat，ITR）和两个开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）Rep和Cap基因组成；ITR是合成互补DNA链的必要条件，对病毒的复制和包装起决定性作用；Cap基因（结构基因）编码病毒衣壳蛋白，Rep基因（调节基因）参与病毒的复制和整合。

重组腺相关病毒（Recombinant Adeno-associated Virus, rAAV）是在野生型AAV基础上改造而成的基因载体。rAAV根据单双链形式又分为两种，单链的ssrAAV和双链的scrAAV（基因组图谱见图1）。

图1 两种rAAV的基因组图谱

由于rAAV病毒载体具有种类多样，免疫原性极低，宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力），扩散能力强，体内表达基因时间长等优势，所以又被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。目前已有3种rAAV基因治疗产品上市（Glybera、Luxturna 以及Zolgensma)，超过200项rAAV基因治疗产品正在进行临床试验。

复制型腺相关病毒（rcAAV）

在rAAV载体生产过程中，转染用质粒DNA与rAAV会由于物理接近而导致rAAV载体基因组、Rep/Cap基因以及ITR序列发生非同源重组，这些重组序列被误包后就形成了具有复制能力的AAV，即复制型腺相关病毒（Replication Competent AAV, rcAAV）(基因组图谱见图2）。

图2 rcAAV的基因组图谱

虽然rcAAV颗粒与目前已知的人类疾病无直接关联，但作为一种污染物，rcAAV颗粒可能会影响rAAV基因表达，并且在许多AAV基因转移研究中被认为是一个不受控制的变量。近期的动物实验表明，Cap基因在体内的表达会引发严重的免疫反应，而包装有其他DNA杂质的rcAAV则具有致瘤性或引入抗生素抗性的潜在风险。采用传统工艺生产的rAAV，rcAAV污染率可高达10%，即使经过工艺优化，污染率也可能达到0.4%-1%，因此需要严格控制rAAV产品中rcAAV的污染。

指导原则：

今年5月，国家药品监督管理局药品审评中心(CDE)发布了《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（以下简称“指导原则”），对基因治疗产品的质量属性分析给出了指导意见，强调基于质量研究和关键质量属性（Critical quality attributes, CQA）的鉴别建立完善的质量控制策略，常见的质量研究项目包括但不限于鉴别、结构分析、生物学活性、纯度、杂质、含量、转染/感染效率、一般理化特性等（见图3）。

图3 AAV基因治疗产品质量控制要求

rcAAV作为生产过程中的工艺杂质，其限度尚未有明确的标准要求，行业普遍建议rAAV病毒原液或终产品（仅比原液多了分装的工艺）中的rcAAV的含量应小于1 rcAAV /10⁸ rAAV vector genome，因此必须采用高灵敏度的方法才能对其进行检测和定量分析。目前rcAAV检测常采用2种方法，即基于细胞培养的检测方法和qPCR快检法。

rcAAV的检测

• 基于细胞培养法的检测方法

该方法的原理是通过不断的细胞传代使得rcAAV实现扩增，之后再利用qPCR或Southern-blot的方法对rcAAV进行检测，能保证检测到的rcAAV都具有复制能力，是目前最常用的检测方法(见图4）。

图4 基于细胞培养法的rcAAV检测方法

然而，其检测敏感性依赖于rcAAV对靶细胞的感染效率，相较于AAV2型来说许多其他AAV血清型（1、3、5、6、7）在培养过程中不能有效地感染靶细胞（例如HECK293/293T细胞），导致检测灵敏度降低，因此其检测值有可能会低于实际值。此外，该方法和检测平台建立有一定难度，需根据实验要求建立易感的细胞株，还需建立均一标定的辅助病毒库以及作为阳性对照的wtAAV病毒库，核酸提取、检测阶段一般都需要进行富集，耗时较长且投入成本较高。

• qPCR快检法（直接检测法）

qPCR快检法，直接检测法，即对rAAV的原液或终产品进行核酸提取后，直接利用qPCR法对rcAAV进行检测。选择的靶标基因一般为ITR、Rep、Cap等的连接序列，可实现对rcAAV上两种基因的检测，与单独检测一个基因(Rep或Cap)相比准确度更高。该方法对实验室的硬件要求不高，检测方法和平台建立相对容易，具有检测时间短，检测成本相较于细胞培养法低的优势。由于该方法检测片段短，故不能保证检测目标具备rcAAV复制所需的完整序列，导致检出的rcAAV不一定具有复制能力，检测值相较实际值偏高。

--

指导原则建议通过全面的质量研究确认产品的关键质量属性，由于分析方法本身可能存在的局限性，可考虑同时采用原理互补的不同方法进行研究。上述rcAAV的两种检测方法，在实际检测中各有利弊。

因此针对rcAAV的检测需要一款既能用于细胞培养后的rcAAV检测，也能用于rcAAV直接检测的试剂盒产品，从而实现在一款检测试剂盒上两种检测方法的相互验证和相互补充。

湖州申科自主研发的SHENTEK^® rcAAV检测试剂盒（PCR荧光探针法），将测试样品中rAAV和rcAAV的数量与定量参考品中Reference基因和Target基因生成的标准曲线比较，分析rAAV载体和rcAAV复制型病毒的浓度，以实现对rcAAV污染的快速、灵敏、特异性定量检测。

该试剂盒产品适用于生产重组腺相关病毒原液、终产品以及基于细胞培养法检测rcAAV的细胞样品，可用于测试rAAV-2/N型和rAAV-5/N型 (N为不同的衣壳血清型)两类血清型rAAV中rcAAV的污染情况。

参考文献：
[1] James A.Allay, Susan Sleep, Scott Long, etc. Good Manufacturing Practice Production of Self-Complementary Serotype 8 Adeno-Associated Viral Vector for a Hemophilia B Clinical Trial[J].HUMAN GENE THERAPY, 2011(22):595-604.
[2] Anna A. Shmidt, Tatiana V. Egorova 1PCR-Based Analytical Methods for Quantification and Quality Control of Recombinant Adeno-Associated Viral Vector Preparations[J].Pharmaceuticals 2022, 15, 23.
[3] Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols[M].2011.