近日，欧洲药典委员会正式通过“高通量测序（High-throughput Sequencing，HTS）检测病毒外源因子”（EP 2.6.41）通则，将于2025年10月在欧洲药典（Ph. Eur）第12.2期发布，并自2026年4月1日起正式生效。这一新增章节为生物制品外源病毒检测提供了更科学、更高效的“官方路径”。

新通则的发布对高通量测序应用于外源病毒检测，尤其是替代体内法和补充体外法检测外源因子污染，以及如何进行合适的方法学验证等方面具有理论和现实的意义。

1. NGS外源病毒检测 适用场景全梳理

HTS(NGS)作为一种最先进且具备高灵敏度的的分子生物学技术，越来越多地用于检测生物制品中的外源病毒污染。

欧洲药典中有众多章节已经关联到了外源病毒检测的内容，例如章节5.2.3.用于生产人用疫苗的细胞基质，章节2.6.16.人用病毒疫苗中外源因子的检测，以及章节2.6.37.应用培养法检测免疫类兽用药品中外源病毒的原则中，皆有提到HTS方法的适用场景。尤其是章节5.2.14. 在疫苗质量控制中应用体外法（in vitro method）代替体内法（in vivo method）中，提到了如何使用广谱的分子生物学方法，包括HTS，来替代体内法检测外源因子污染。

NGS外源病毒检查法适用于生物制品行业（人或兽用疫苗、重组蛋白、基因治疗中的病毒载体和细胞治疗）中细胞库和病毒库的检定，以及中间环节放行检（包括unprocessed bulks，UPB)，但应用于生物制品终产品的放行检查仍有争议。ICH Q5A R2指导原则中提到非靶向NGS可用来替代体内检测，补充或替代体外细胞培养检测，在证明方法达到其预期目的的基础上无需进行头对头比较,原文表述“Non targeted NGS can be used to replace the in vivo assays and supplement or replace the in vitro cell culture assays, without a head-to-head comparison as long as the method is demonstrated to be suitable for its intended purpose”。目前行业内普遍接受用NGS方法替代体内法（动物实验），用NGS方法作为体外法（细胞培养）的补充。

HTS工作流程示例（源自EP 2.6.41章节）

2. NGS检测外源病毒 核心考量全解析

依据不同的样品类型或基质类型，NGS的分析策略有三个方向，Genomics（所有的病毒基因组，包括DNA和RNA），Viromics（被病毒衣壳保护的病毒基因组）和Transcriptomics（病毒RNA）。

NGS对于逆转录病毒的检测尤为复杂，原因在于宿主细胞基因组中可能携带内源性逆转录病毒序列。

目前NGS测序技术根据测序读长（reads）可以被划分短序列测序（short-read sequencing technologies，<500 bp）和长序列测序（long-read sequencing technologies, >1000 bp），因此选择合适的测序方式和工作流程尤为重要。

完整的NGS检测外源病毒工作流程，一般包括样品前处理、核酸提取、核酸提取后病毒核酸处理、文库制备和测序、使用参考数据库进行数据分析、对结果进行科学评估，以及在出现阳性信号时进行后续调查（Follow-up investigation）等步骤。在NGS方法验证中，加标材料（spiking materials）的选择和结果评估对应的性能参数设定，以及产品特异性的验证等都应纳入考量范围。

3. NGS检测外源病毒 方法验证全攻略

NGS检测外源病毒的方法验证策略，对NGS外源病毒检测方法的适用性尤为重要。现行的法规层面总体参考ICH Q2指导原则和最新的欧洲药典 EP Chapter 2.6.41，针对NGS替代外源病毒检测传统方法，包括体外法和体内法等，有较为详尽的描述。