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USP<1132>中较为详细地介绍了HCP ELISA试剂盒开发的流程，主要包含HCP抗原及校准品的制备、抗体的制备以及检测体系的开发与验证。为确保所开发检测试剂盒的良好性能，法规对开发过程中各环节均提出了明确的要求。
1. 抗原具备代表性，校准品赋值准确，溯源清晰
HCP ELISA定制化检测试剂盒，通常使用空细胞或空载细胞模拟实际生产工艺进行生产，根据实际工艺收获制备相应的抗原。因此，法规要求采用2D-SDS/PAGE或LC-MS等多种方法对抗原和实际生产工艺中所产生HCPs进行深入分析，确保所选择的作为抗原的HCPs可以充分覆盖实际生产工艺中的HCPs的种类，保证抗原与实际残留的HCPs的代表性。
图1.采用2D-SDS/PAGE法表征抗原的HCPs代表性：模拟工艺抗原2D电泳银染图谱，蛋白点数591；实际工艺HCPs 2D电泳银染图谱，蛋白点数：574
图2.采用LC/MS法表征抗原的HCPs代表性：模拟工艺抗原LC-MS方法分析，蛋白数1688；实际工艺抗原LC-MS方法分析，蛋白数：1560（A：实际工艺样品特有蛋白数；B：模拟工艺样品特有蛋白数；C：二者共同蛋白数）
抗原选择：
以CHO宿主表达抗体或重组蛋白来讲，一般是收获空载细胞上清收获液，对其进行离心或膜包过滤，浓缩换液处理，再进行校准品制备和动物免疫。
校准品作为关键原材料，其良好的稳定性和溯源保障对生命周期至关重要。为确保校准品的稳定，一般采用冻干工艺制备校准品，用单因素方差分析方法对校准品进行均一性评估，采用法规规定的蛋白定量方法进行校准品的赋值，并溯源至国家标准品（如有）或BSA国家标准品。
图3.HCP校准品溯源链
2. 抗体性能优异，覆盖率高，批量大
动物免疫前，通常需要确认待免疫动物的血清对目标产品蛋白是否有交叉反应。由于HCPs是复杂的多分析物，为制备尽可能高覆盖率的抗体，覆盖工艺下特有的高风险HCPs，需采用可靠的免疫策略。免疫过程中，进行血清和效价的检测；收获血清后，可采用ProteinG纯化的方法，并对抗体进行性能表征，确保抗体的浓度、纯度、效价等指标满足检测要求。
得到符合性能要求的抗体后，需采用经过验证的可靠的2D或LC-MS方法进行抗体覆盖率的表征，以确保抗体可以充分覆盖各实际工艺下产生的HCPs。
图4.LC-MS HCP抗体覆盖率分析图
3. 检测体系稳健，方法验证合规，供应稳定
得到了具有代表性的抗原和性能优良的抗体后，便是ELISA检测体系的开发，主要包括原辅料的筛选和制备研究、各组分工艺及反应体系研究、稳定性研究等。
为达到最优的抗体固相化效率，同时兼顾检测灵敏度和包被一致性，抗体包被过程需要优化抗体的浓度、配比，缓冲液的离子强度及pH，反应过程的温度与时间，封闭方法，洗涤与干燥等工艺参数。此外还需要进行包被过程中使用的试剂、耗材等原辅料的测试评估。
同时，为达到良好的检测灵敏度及检测特异性，抗体标记过程需要在维持抗体构象稳定的前提下，选择兼容性较好的标记物进行标记，并且对偶联方法进行优化评估。
检测体系开发完成后，需要根据ICH及药典要求进行分析方法验证的评估，以确保整个检测体系的线性、范围、检测限、定量限、准确度、精密度、专属性以及耐用性等可以满足法规要求。
另外，抗体预包被的酶标板、校准品、标记后的抗体、试剂盒等还需进行充分的稳定性评估（如长期稳定性、加速稳定性...），同时需要稳定的生产工艺以确保定制化试剂盒可以满足长期稳定的供应。
表1.定制化HCP ELISA试剂盒标曲性能
表2.定制化HCP ELISA试剂盒批内批间精密度
综上所述，HCP ELISA定制化开发平台需要具备完善的开发体系，可靠的技术平台，专业的开发团队，以实现长期稳定供应符合法规要求的试剂盒。
湖州申科在HCP ELISA检测技术领域深耕多年，已建立高质量的技术先进的HCP ELISA试剂盒全流程自有开发平台，涵盖抗原表征/制备、动物免疫、抗体制备、体系开发及验证平台，确保输出的HCP ELISA检测试剂盒性能满足用户申报需求，已服务国内外200+家生物医药企业。
