端粒是染色体末端的重复核苷酸元件，具有保护染色体不被核酸酶降解、防止染色体相互融合、保证染色体的完全复制的作用。端粒的DNA序列既具有高度的保守性，如原生动物、真菌、高等植物及高等动物的序列都很相似，又具有种属特异性，如，草履虫为TTGGGG，人类和哺乳动物为 TTAGGG。在大多真核生物中，端粒的延长是由端粒酶催化的。

图1 端粒在染色体末端形成帽子结构^[4] 

端粒酶是一种含有RNA的逆转录酶，可通过引物特异识别位点以自身 RNA 为模板，在染色体末端合成端粒 DNA，使端粒得以延长。端粒酶在正常人体细胞中的活性被抑制，只有在造血细胞、干细胞和生殖细胞这类必须不断分裂的细胞之中才可以检测到具有活性的端粒酶。 

随着组织细胞工程学的兴起，干细胞治疗也越来越受到人们的关注。端粒长度和端粒酶活性的检测，常常被用于评价扩增后的干细胞分化、自我更新能力、增殖潜能以及遗传稳定性等。

此外，大量的研究表明端粒酶在恶性肿瘤细胞中被重新激活，端粒酶活性已被证明是所有已知肿瘤普遍存在的标志物，也是抗肿瘤治疗的希望靶点。因此，端粒酶活性的定量检测在肿瘤发生和干细胞的干性评价等细胞生物学方面意义重大。

图2 端粒酶合成端粒示意图^[5]

❖ 法规要求

NMPA和CDE发布：有关干细胞制剂质量控制中要求进行端粒酶活性检测。

表1  端粒酶活检测的相关法规

端粒酶活性检测经典的方法是 1995年Piatyszek 等提出的端粒重复扩增方法（TRAP）。此后人们对该方法进行了诸多改良，使得该方法在灵敏度和特异性方面取得了较大的提高。

此外，近年来很多新的端粒酶活性检测策略，如化学反应发光法、电化学法、荧光分析法、比色法等也相继被开发。但这些方法在实际应用过程中，仍然具有一定局限性，比如化学反应发光法中的酶容易降解， 易受到环境的干扰，检测成本高；电化学法检测端粒酶活性存在信号探针不稳定、需要添加额外的氧化还原介质等问题；荧光分析法中的信号探针常常需要复杂的合成步骤且生物兼容性差，产生的背景噪声大大降低了检测的灵敏度；比色法的检测现象明显，但灵敏度普遍较低，难以实现原位检测等。

综上所述，TRAP法及其改良方法是目前表征端粒酶活的最佳方法，其中Real-time Quantitative TRAP法因检测灵敏度高，耗时最短，通量高，可精确定量，已被广泛接受和应用于端粒酶活性检测。

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SHENTEK^® 端粒酶活检测试剂盒（RQ-TRAP法）

湖州申科基于端粒重复扩增方法（TRAP）结合荧光定量PCR技术创新开发了SHENTEK® 端粒酶活检测试剂盒（Real-time Quantitative TRAP法，即RQ-TRAP法）。此试剂盒包含双重荧光qPCR反应体系：

● 内参基因：以此来评估待测样品中是否存在PCR抑制物，排除假阴性的可能；

● TSR8为定量参考品：可精确地检测待测样品的端粒酶活，定量限0.4TPG/rxn或2个A549细胞/rxn及以下。

SHENTEK®端粒酶活检测试剂盒（RQ-TRAP法）通过荧光定量PCR仪实时检测荧光信号值，双重qPCR法，减少了试剂和样本的使用量，提高了检测通量；并且为闭盖检测，无需开盖及后续的凝胶电泳或ELISA分析等繁琐操作，极大地提高了检测效率，同时降低了样品污染风险。

表3  真实细胞样品检测结果

参考文献：