《欧洲药典》2.6.41通则“高通量测序（High-throughput Sequencing，HTS，也称作NGS）检测外源病毒因子”将于2026年4月1日起正式生效。”NGS 技术正式成为生物制品外源病毒质控的合规方法，行业也从 “要不要用 NGS” 的讨论，进入了 “怎么把 NGS 方法做合规、做扎实” 的实操落地阶段。

在《NGS外源病毒检测-适用场景和方法验证策略》中，梳理了“NGS 方法能用在哪、验证要覆盖哪些核心维度”的基础问题。本期我们将聚焦 NGS 方法学验证落地的核心关键 —— 验证用病毒标准盘，聊一聊什么样的标准盘符合国际法规要求？如何完成标准盘的规范制备与全性能验证？

WHO在2024年1月正式发表的文章：“A Collaborative Study to Evaluate the Proposed First WHO International Reference Panel for Adventitious Virus Detection in Biological Products by High-throughput Sequencing (HTS) Technologies”，依据不同的病毒基因组类型、有无包膜和理化抗性等推荐了7种病毒作为NGS外源病毒检测的标准盘（表1）。

表1. WHO第一版NGS外源病毒检测标准盘

结合最新发布的EP 2.6.41章节和ICH Q5A(R2)指导原则，本文旨在阐明NGS外源病毒检测用标准品的模型病毒选择策略和制备要点，提供标准盘在方法验证中的实际应用指南。

一、验证用病毒标准盘，选择策略与制备标准

EP 2.6.41章节提到“为了确保HTS测试的有效性，每次HTS检测都需要随行外部或内部阳性对照，尤其对于Genomics或Viromics Approach分析方法，设置的对照病毒应包含一定数量的DNA和RNA病毒或病毒样颗粒，掺入合适的基质中”。在正式实验之前，有必要对NGS外源病毒检测的方法进行验证，以证明该检测方法有足够的灵敏度和特异性。

1.1 加标材料选择

通常在Genomics或Viromics Approach的分析方法中，使用模式病毒加标到检测体系中，而Transcriptomics approach则需要加标感染后的细胞。加标材料的选择应基于风险评估并考虑到样品类型、分析策略和检测方法的预期用途等因素。验证用的加标材料可能有不同的来源，例如模型病毒或感染后的细胞，应当关注它们的溯源、成分和纯度等关键信息，以便正确评估该方法的性能。

如采用Transcriptomic approach检测细胞基质/细胞库，则不同病毒感染的细胞为最佳加标物质。模式病毒感染后的细胞也需要注释感染vs非感染细胞数量，病毒基因表达的确认，病毒序列和宿主背景等参数。

1.2 参考品选择

章节3.2. SELECTION OF SPIKING MATERIAL FOR VALIDATION中，明确提到采用基因组学和病毒组学方法检测细胞基质/细胞库、病毒种子和收获物的分析方法，相应的参考品应为具备代表性的模型病毒，且应充分考量它们的病毒特性，基因组类型（单双链、DNA/RNA、线性/环状、基因组大小）、物理特性（颗粒大小、有无包膜）和化学特性（低、中和高抗性）。

1.3 标准盘选择

以WHO国际标准盘为例，明确其用途为生物制品NGS外源病毒检测，标准盘提供了7种不同病毒类型（REO、FeLV, RSV, PCV, EBV, hCoV和MVM），建议将其作为验证用模型病毒的最小标准盘。以上模型病毒需注释基因组拷贝数、感染滴度、病毒基因组序列（包括任何变体）以及任何其他的背景信号等参数。

二、SHENTEK^® NGS 病毒标准盘，制备流程和等效性验证

湖州申科依托自有外源风险因子质控平台，立足于对国内生物制药行业的理解和客户需求，推出了自有知识产权的SHENTEK^® NGS外源病毒检测体系。同时参考国际标准，建立了符合生物制品质量控制要求的病毒标准盘。

• 标准盘由7种模式病毒组成（REO、MLV、RSV、PCV、EBV、BVDV和MVM）(表2）。

• 标准盘加入了生物制品行业中常见污染的牛源病毒BVDV和鼠源病毒MLV，更为贴近生物制药行业的需求。

• 标准盘依据EP 2.6.41章节和ICH Q5A（R2）指导原则进行了充分的性能验证，可达到与WHO标准盘等效的性能。

表2. SHENTEK^® NGS验证用病毒标准盘

SHENTEK^® NGS验证用病毒标准盘采用可溯源的种子病毒生产的高浓度病毒原液，经超速离心和切向流浓缩换液后获得，具有高纯度和低宿主残留的特点，可满足生物制品NGS外源病毒检测的要求。

病毒标准品制备流程

(1)建立病毒种子库
国内外权威保藏机构引进的种子病毒（如ATCC等），建立三级病毒库，包括种子病毒库（SVB)、主病毒库(MVB)和工作病毒库(WVB)。
(2)病毒扩增和病毒原液收获
参考WHO病毒标准盘的制备标准，工作代病毒在易感细胞中扩培后，反复冻融并低速离心，保留上清即为病毒收获液。
(3)高纯度病毒收集（合适介质密度梯度离心）
病毒收获液经密度梯度超速离心后，收集目标条带，获得高纯度病毒收获液（去除杂质）。
(4)超离介质去除并浓缩
高纯度病毒收获液中含有高浓度超离介质，为减少对后续操作的影响，采用切向流（TFF）或层析纯化的方法去除介质并保存于病毒保存液（含0.5% BSA、10mM Tirs-HCl、135mM NaCl、5%海藻糖）或PBS中，洗脱体积控制1CV，进一步提高病毒标准品浓度。
(5)病毒标准品赋值
采用数字PCR（dPCR)对病毒标准品赋值后分装，并对病毒标准品进行质检后放行入库。

2.1 病毒标准盘的性能验证

参照WHO发布的病毒标准盘的验证标准，湖州申科对新建的NGS验证用病毒标准盘进行了系统的性能验证,主要包括系统适用性、检测限、专属性及检测范围三个部分。

• 系统适用性验证: 对工作流程中关键步骤（核酸提取、文库构建、生信分析）进行验证质控以评估该系统的性能。

• 检测限验证：不同类型的病毒标准品按照基因组拷贝，按10倍梯度稀释至理论检测下限（1E5、1E4、1E3、1E2 VGC/mL），掺入到1E9 VGC/mL的Adv5中进行测试，在设置的检出标准下检测限可达10³GC/mL。

• 专属性（及检测范围）验证：在基质样品中混合多种病毒参考品，验证多种病毒共存时的鉴别能力。最终结果中，混合病毒全部稳定检出，无其他假阳性检出。

表3. SHENTEK^® NGS验证检测用病毒标准的COA

三、验证用病毒标准盘的使用注意事项

从行业需求和现行法规要求出发，NGS外源病毒检查法适用于细胞库和病毒库的检定，以及细胞和基因治疗产品的中间环节放行检。虽然ICH Q5（R2）指导原则中明确指出，NGS方法用于替代体内法和替代/补充体外法进行外源病毒检测，无需做头对头的比较，但在正式实验前仍有必要对NGS方法进行充分验证或确认。加入病毒标准品进行NGS外源病毒检查方法验证的目的，在于验证NGS外源病毒检测的实验流程是否具有足够的特异性、灵敏度和样品适用性。

因此针对外源病毒检测的特定场景，病毒标准盘的加入可以实现NGS检测全流程质控，从样品准备和核酸提取、文库构建和高通量测序、以及生信分析。除提供高质量的病毒标准盘以外，合理的病毒标准品掺入方式、高效的核酸提取和文库构建策略，以及经验证的生信分析流程才能保证上述的病毒标准盘在性能验证中稳定检出。

注：病毒标准品应在BSL-2实验室操作，实验人员需经过生物安全上岗培训且应正确穿戴个人防护用品(PPE)。