生物技术药物往往是借助工程细胞进行大规模生产，如CHO、Vero、MDCK、HEK293、Sf9等。在生产过程中，这些宿主细胞会分泌其他蛋白质，伴随着细胞老化破裂产生的大量胞内蛋白等，形成与产品不相关的杂质，统称为宿主细胞蛋白质（host cell protein，HCP）。HCP的存在可能导致产品不稳定、疗效差等质量风险，还能引发病人的免疫副反应等安全风险，已成为药物生产质控中的关键质量属性（critical quality attribute，CQA）之一。

酶联免疫吸附法-HCP经典检测法

美国药典、欧洲药典和中国药典中均阐明首选酶联免疫吸附试验（ELISA）来进行生物制品中残留HCP的检测，该方法具有操作简便、快速，可高通量，原液或稀释后直接检测等优点。HCP ELSIA检测的基本原理是基于HCP的多克隆抗体来识别并捕获样品中的HCP，采用双抗体夹心进行检测。USP<1132>章节对该方法的开发做了详细的介绍，并对抗体表征部分提出了非常重要的一点：需要证明HCP多克隆抗体能识别HCP的比例，即覆盖率评估。

覆盖率评估方法

HCP本身是多种蛋白质的混合物，因此目前在方法上均是基于蛋白质组学技术，USP对抗体覆盖率评估的2种方法进行了对比（图1）。本文将从覆盖率评估原理入手，对不同覆盖率评估方法进行进一步分析。

图1 USP<1132>两种覆盖率评估方法对比

• 2D-Western Blot

二维电泳结合蛋白质免疫印迹方法（图2）。选取两块相同的胶对一个HCP样品进行二维电泳，其中一块进行免疫印迹实验，将胶中HCP蛋白转移到膜上，然后进行HCP抗体孵育结合，洗涤后采用ECL或荧光等方式扫描成像；另一块采用银染的方式进行扫描成像；在专用的分析软件中对两块胶中的蛋白质点进行匹配分析，计算得到覆盖率水平。目前可以实现采用不同荧光标记和荧光显色的方法在一块二维电泳胶上进行覆盖率分析，一定程度上提升了评估的准确性，如2D-DIGE。

图2 2D-Western blot流程图

传统的基于蛋白质二维电泳和免疫印迹方法评估HCP多抗覆盖率，在实际运用中有诸多局限，比如结果的重复性差，数据比对分析困难，难以标准化等。如图3右侧Western Blot图上常见大块区域，无法区分具体蛋白识别情况，覆盖率结果主观因素大。此外，该方法条件下HCP蛋白质容易变性，与ELISA检测条件的表位差别较大，使得结果不准确。因此，该方法目前已不推荐使用。

图3 USP<1132>覆盖率对比图示

• 基于免疫捕获结合二维电泳技术

▸ AAE-2D

AAE(Antibody Affinity Extraction)-2D是基于免疫层析柱和二维电泳的方法。该方法是将HCP抗体偶联到层析填料上，然后上样HCP样品，过程中HCP抗体捕获结合可以识别的HCP，而未识别的HCP则因不会捕获而流穿，最后通过低pH等洗脱条件收集能识别的HCP。将捕获前HCP样品和捕获洗脱样品分别进行二维电泳和银染显色分析，计算获得抗体的覆盖率（图4）。

图4 免疫柱层析捕获法

▸ IMBS^®-2D

湖州申科采用免疫磁珠分离结合二维电泳方法评估抗体覆盖率（图5）。其设计思路是将HCP抗体偶联到磁珠上，HCP样本与磁珠共同孵育，过程中HCP抗体捕获结合可以识别的HCP，而未识别的HCP则因不会捕获而被洗涤步骤清除，最后通过低pH等洗脱条件收集能识别的HCP。将捕获前HCP样本和捕获洗脱样本分别进行二维电泳和银染显色分析，计算获得抗体的覆盖率。

图5 IMBS-2D技术原理

除了拥有AAE的优点外，该方法最大的特点是利用了免疫磁珠的半液态性质，  可以在悬浮的条件下与HCP样品充分混匀结合，与ELISA检测条件一致，HCP无需变性处理，并且结果重现性非常好。由于捕获效率高，抗体的使用量也相对较少，具有操作简便，可实现自动化的显著优势。

以某HCP样品检测覆盖率评估为例:

图6为基于IMBS^®-2D技术平台获得的电泳结果。采用二维电泳分析软件识别蛋白质点，从红色虚线框分隔的四象限均有很好的覆盖度，表明抗体的覆盖率水平比较高。

图6 HCP 覆盖率评估IMBS-2D方法案例

• 基于免疫捕获结合高分辨率生物质谱技术

HCP的种类和含量对生物制品质量研究至关重要。部分高风险因子，如在单抗生产工艺中来源CHO细胞的PLBL2等，被证明有较大的人体免疫反应，这就要求企业在进行产品工艺、质量研究时务必做到充分识别，开展针对性的下游工艺优化，最终将产品潜在风险控制在限度范围内。

然而，无论是上述何种方法，其最大缺点是无法对HCP多抗能识别的HCPs蛋白进行鉴定并进一步定量分析。基于此，湖州申科搭建了高分辨蛋白质谱技术平台，结合IMBS技术，用质谱方法取代二维电泳法，推出了IMBS-MS抗体覆盖率评估方法。该方法采用质谱分析技术，可准确鉴定HCP校准品包含的蛋白种类和相对丰度，结合HCP多抗能识别的蛋白质种类，通过两者匹配计算得到更真实的覆盖率。与此同时，还可获得更多的表征信息，展现监管机构更加关注的高风险HCP的识别情况，帮助企业优化生产工艺，更好地筛选产品质量控制用HCP检测试剂盒。

图7 IMBS-MS分析流程

近年来，法规及监管机构（包括ICH、USP及FDA）均在不断强化药物分析方法全生命周期管理意识，并引入了分析方法质量源于设计(AQbD)理念。对生物药企业来说，如何做好分析检测方法顶层设计，加强方法风险管理是在方法建立之初需要考虑的首要问题。

在生物制品质量控制检测领域，应从产品本身的特点入手，综合考虑其生产工艺、使用场景、风险分析等，充分理解质量控制需求和要求，聚焦产品过程质量控制的关键质控点并选择合适的技术来设计开发检测方法。以上述覆盖率水平评估方法为例，从传统的2D-Western Blot到IMBS-2D再到IMBS-MS，湖州申科在符合法规要求的前提下，关注方法开发的风险管理，将“持续改进”理念贯穿于方法开发的各个环节和整个生命周期，持续提高检测方法的准确性和可靠性，以期为客户提供系统性的解决方案。

✦ 覆盖率评估属于定性分析，要求是稳定性好，灵敏度高，与ELISA检测的原理相似，确保结果准确可靠。

✦ 基于电泳的技术，依赖高质量的电泳结果，要求染色蛋白质点清晰，但在结果分析的过程中人为判定的影响较重，容易导致结果不可靠。因此，基于免疫捕获+质谱技术的运用会越来越多。

✦ 不同技术平台获得的覆盖率水平是不一样的，一般覆盖率水平从高到低依次IMBS-MS>IMBS-2D>2D-Western Blot。

✦ 覆盖率评估分析需要考虑不同方法间存在的差异，以及如何持续改进和评估方法实验过程的质量控制。

参考文献：

[1] USP<1132>,“Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals”.

[2] EP 2.6.34,“HOST-CELL PROTEIN ASSAYS”.