①支原体检测

     主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时,应同时进行培养法和指示细胞培养法(DNA染色法)。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体,必要时,亦可采用指示细胞培养法筛选培养基;也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。

    a. qPCR 法

     采用qPCR荧光探针法,通过特异性引物、探针(FAM标记)扩增检测支原体基因组中16S rRNA编码区,定性检测样本中支原体DNA,涵盖了120多种支原体DNA序列;检测快速,专一性强,性能可靠,参照EP 2.6.7和JP XVII支原体检测相关要求进行验证;用于主细胞库、工作细胞库、病毒种子库以及临床治疗用细胞的检测。
内部质控(IC,VIC标记)可在PCR扩增反应阶段加入,以判断待检样本对扩增反应是否存在抑制,防止假阴性结果的产生;也可在样本提取阶段加入,以评估提取效果。
采用磁珠法提取纯化支原体DNA,高效提取样本中的支原体DNA,确保检测限可达到10 CFU/ml。
    NAT测试系统要求
        – 作为培养法的替代方法:NAT测试系统必须检测到10CFU/mL
        – 作为指示细胞培养法的替代方法:NAT测试系统必须检测到100CFU/mL
        – 内部质控IC(整个过程:提取、逆转录、扩增、检测)
        – 外部质控(PC、NTC、NCS)

质控结果分析

Ct-PC

Ct-NTC

Ct-NCS

FAM

VIC

FAM

VIC

FAM

VIC

<40

<40

Ct40或无扩增

<40

Ct40或无扩增

<40

待测样本检测结果分析

FAM

VIC

结果判断

Ct<40

<40

阳性

Ct40或无扩增

有抑制

Ct40或无扩增

Ct<40

阴性

Ct40或无扩增

有抑制


    b.培养法

    每支培养基接种供试品0.5ml-1.0ml,于特定环境下培养28天后观察培养基的变化,与阴阳性对照培养基作比较。
培养基的选择:支原体肉汤培养基,精氨酸支原体肉汤培养基,支原体肉汤半流体培养基(支原体肉汤琼脂培养基),精氨酸支原体肉汤半流体培养基(精氨酸支原体肉汤琼脂培养基),选取液体和半流体培养基或者液体和固体的培养基用于支原体的检查。亦可使用其他培养基,但灵敏度必须符合要求。
培养基灵敏度检查(变色单位试验法):(1)菌株肺炎支原体(ATCC15531株)、口腔支原体(23714株,)由国家检定机构分发。灵敏度为10cfu/ml,是药典上最普遍的方法,不过检测时间过长,操作过程也繁琐,结果判定的有一定的人为因素。


    c.指示细胞法

   将供试品接于指示细胞(无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞)中培养后,用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体,在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DAN着色。灵敏度为100cfu/ml,中国药典检测支原体的另一种方法,时间大约也需要20天,容易污染,结果判定有也一定的人为因素。
结果判定:
    ⑴ 阴性对照:仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。
    ⑵ 阳性对照:荧光显微镜下除细胞外,可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。
    当阴性及阳性对照结果均成立时,试验有效。



    d.法规

     EP9.0-2.6.7.支原体/JP17-支原体

    ②无菌检测

    无菌检查法系用于检查药典要求的无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。





    ③分枝杆菌检测

    ④病毒检测

     用哺乳类工程细胞生产的产品,包括临床治疗用细胞制品,根据ICH相关指导原则,不确定的病毒污染是一项重要的安全考量,可用in vitro方法来检测。SHENTEK可为细胞库,种子库,原材料和终产品提供in virto检测和客户定制化检测。
     In-vitro方法检测内源或不确定的病毒。




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